Bücher der Reihe Schriftenreihe des Institutes für Bioverfahrenstechnik der Technischen Universität Braunschweig

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die biologischen und chemischen Reaktionsprozesse in Siedlungsabfällen in Reaktionssystemen unterschiedlicher Größe untersucht. Der Schwerpunkt lag dabei auf anaeroben Abbauprozessen, die unter anderem anhand der Gasbildung und der DOC-Konzentration im Sickerwasser analysiert wurden. Neben der Identifizierung von Einflussparametern stand die Frage der Übertragbarkeit von Modellen über biologische Reaktionsprozesse von kleineren auf größere Reaktionssysteme im Vordergrund. Die Simulation der Gasbildung erfolgte durch den Einsatz von künstlichen neuronalen Netzen (KNN). In experimentellen Untersuchungen wurden Umgebungseinflüsse wie der pH-Wert und die Säurepufferkapazität im Abfall genauer untersucht. Die beim Abbau der organischen Substanz im Abfall beteiligten hydrolytischen Prozesse und die gleichzeitig zu beobachtende Biofilmbildung konnten durch den Einsatz der Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT) visuell dargestellt und quantifiziert werden.

Biopharmazeutika wie Antikörper und Hormone repräsentieren etwa ein Fünftel der kommerziellen Pharmazeutika. Für die rekombinante Produktion dieser Proteine sind diverse Stämme der Gattung Bacillus vielversprechende alternative Kandidaten. Sie sind einfach zu kultivieren, apathogen und sekretieren korrekt gefaltete Proteine mit hoher Effizienz. Einige der anspruchsvollsten heterologen Proteine sind Antikörper und ihre Fragmente sowie große multimere Enzyme wie die Penicillin-G-Acylase (Pac). Antikörperfragmente werden aufgrund ihrer hoch-spezifischen Antigen-Bindung vielfach therapeutisch, diagnostisch und analytisch eingesetzt, wobei single-chain fragment variable (scFv) das kleinste herkömmliche Format darstellt. Pac wird für die Herstellung semisynthetischer ¿-Lactam-Antibiotika benötigt. Gegenstand dieser Arbeit ist die skalenübergreifende rekombinante Produktion und Sekretion des Antikörperfragments D1.3 scFv und der Pac mit B. megaterium, B. licheniformis sowie mit B. subtilis-Stämmen unterschiedlicher Protease-Aktivität.Die Produktion, Sekretion und Reinigung des D1.3 scFv wurde durch ein Plasmid ermöglicht, das einen Xylose-induzierbaren, für B. megaterium optimierten, Promotor und Sequenzen für das Signalpeptid SPlipA und einen fusionierten His6-Tag aufweist. Die Sekretion von funktionalem D1.3 scFv wurde für B. megaterium MS941, B. licheniformis MW3 sowie B. subtilis 168, DB431 und WB800N in einem angepassten Minimalmedium gezeigt. Skalenübergreifend erfolgte die Produktion in Mikrotiterplatten (1,25 mL), Schüttelkolben (150 mL) und Rührkesselreaktoren (2.000 mL). Es wurden extrazelluläre Konzentrationen von 15 130 mg L 1 erzielt. Für B. subtilis stiegen Menge und Stabilität des D1.3 scFv, je geringer die Protease-Aktivität des Stammes war.Für die rekombinante Produktion der Pac wurden ebenfalls Xylose-induzierbare Plasmide konstruiert. Die Sekretion konnte für B. megaterium MS941 und ATCC14945 sowie für B. subtilis 168 und WB800N im Schüttelkolben (150 mL) gezeigt werden. Die maximalen extrazellulären Aktivitäten betrugen 0,3 0,65 U mL 1, wobei die Protease-Defizienz in MS941 bzw. WB800N auch hier eine Aktivitätszunahme bewirkte. Ein fusionierter C terminaler His6-Tag wirkte sich negativ auf die Pac-Aktivität aus.Das hohe Potenzial von Stämmen der Gattung Bacillus für die rekombinante Produktion von pharmazeutisch relevanten anspruchsvollen Proteinen wie Antikörperfragmenten und großen multimeren Enzymen konnte skalenübergreifend von 1,25 bis 2.000 mL Kulturvolumen demonstriert werden. Mit 130 mg L 1 wurden die bisher höchsten extrazellulären Konzentrationen eines Antikörperfragments für ein Gram-positives Bakterium erreicht. Auch wurde die artübergreifende Anwendung der hier konstruierten, für B. megaterium optimierten, Plasmide demonstriert.

BeschreibungIn der vorliegenden Dissertation wird untersucht, ob mittels Kraftstoffadditivierung Stickoxidemissionsminderungen erreicht werden können und gleichzeitig die Oxidationsstabilität des Kraftstoffs positiv beeinfluss werden kann.Hierzu wurden Carbonsäurehydrazide gezielt so designed, dass deren Löslichkeit im Kraftstoff in additivrelevanten Konzentrationen sichergestellt ist. Anschließend konnten die entsprechenden Hydrazide synthetisiert, charakterisiert und mittels Brennkammerversuchen bzw. Oxidationsstabilitätstests untersucht werden.Es wird gezeigt, dass Hydrazide die Oxidationsstabilität von Kraftstoffen erhöhen und dass sich in Brennkammerversuchen stickoxidemissionsmindernde Tendenzen finden lassen. Zudem werden mögliche zugrundeliegende Mechanismen beleuchtet und diskutiert.

Die vorliegende Arbeit setzt sich auseinander mit dem Biofilmwachstum von Pseudomonas aeruginosa in einem replikativen Kultivierungssystem, das eine katheterassoziierte Harnwegs-infektion simuliert.Es werden drei, aufgrund ihrer Eigenschaften ausgewählte klinische Isolate eingesetzt, wobei u. a. die Beweglichkeit und die Fähigkeit der Biofilmbildung berücksichtigt wurden. Das Biofilmwachstum der P. aeruginosa-Stämme wird mit Hilfe des Kultivierungssystems charakterisiert und mit dem Referenzstamm P. aeruginosa PA14 verglichen. Als spezifische Parameter werden u. a. die maximale Biofilmwachstumsrate, die Biofilmdicke und -dichte sowie die Zellzahl im Biofilm ermittelt. Die Entwicklung phänotypischer Kolonievarianten, die einen weiteren charakteristischen Parameter der Pseudomonas-Biofilme darstellt, wird in Abhängigkeit von den Prozessparametern herausgestellt. Darüber hinaus wird der Einfluss des Antibiotikums Ciprofloxacin und einer gepulsten mechanischen Beanspruchung auf die Biofilme bzw. deren Entwicklung untersucht.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird eine umfassende Charakterisierung der Morphologie und Produktbildung des Modellstammes Aspergillus niger SKAN1015 in Abhängigkeit von verschiedenen environomischen Bedingungen durchgeführt. Beispielhaft erfolgt in Batchkultivierungen die Variation des volumenbezogenen rührerinduzierten Leistungseintrags (6 bis 2919 W m-3), der Sporenkonzentration zu Kultivierungsbeginn (104 bis 107 Sporen mL-1) sowie des pH-Werts (konstanter pH-Wert, pH-Shift) als maßgebliche Faktoren, die die Morphologie und Produktbildung beeinflussen. Als Modellprodukt wird dabei das homolog-rekombinante Enzym ¿-Fructofuranosidase (SUCA, EC 3.2.1.26) unter Regulation des konstitutiven Promotors der Pyruvatkinase (Ppki) betrachtet. Zur Beschreibung der Morphologie in Abhängigkeit vom Environom wird kultivierungsbegleitend das Biomasse- und Pelletwachstum u. a. anhand bildanalytischer Auswerteverfahren bestimmt sowie die intrapartikuläre Pelletstruktur über mikroskopische Aufnahmen und Mikrotomschnitte repräsentativer Pellets charakterisiert. Die Bildung von ¿-Fructofuranosidase wird ausgehend von der Genexpression über die Synthese bis hin zur Freisetzung in den Kultivierungsüberstand unter Berücksichtigung environomischer und morphologischer Parameter untersucht. Darüber hinaus werden zur Analyse des physiologischen Zustands der Biomasse sowohl Stoffwechselprozesse als auch Expressionsanalysen ausgewählter Gene aus den Bereichen Morphologie, Metabolismus, Stressantwort und Sekretion betrachtet. Durch diese systematische Analyse von Prozessen auf genetischer, mikro- und makroskopischer Ebene werden vielfältige Verknüpfungen von Environom, Morphologie und Produktbildung identifiziert und schließlich Optimierungspotentiale des Produktionsprozesses mit filamentösen Mikroorganismen aufgezeigt.