Bücher von David Kateete

Tb. Os genes da tubulina alfa e beta de brucei foram expressos em E. coli usando o plasmídeo de expressão pTrP2 e ácido 3-¿-indoleacrílico como indutor. As tubulinas expressas foram analisadas por SDS-PAGE e confirmadas por Western blotting, em que tinham uma massa molecular aparente idêntica de 50 kDa. As tubulinas expressas foram dissolvidas individualmente em Ureia 8 M e diluídas 20 vezes, após o que foram concentradas e dialisadas extensivamente contra tampão MES. Após a diálise, o rendimento médio para a tubulina alfa e beta foi de 0,7g por litro de cultura. Os anticorpos policlonais foram produzidos em cada um dos 56 coelhos imunizados com três doses de tubulinas concentradas a 150¿g ou 450¿g por imunização por animal. O efeito desses anticorpos em T. b. o crescimento de brucei foi estudado por cultura de T. b. Brucei na corrente sanguínea se forma em até 25% dos anti-soros criados em coelho. Os anti-soros dos outros coelhos não inibiram T. b. crescimento de brucei em cultura. Estes resultados mostram que os anticorpos para a tubulina tripanossômica expressa em bactérias podem não ser citotóxicos para T. b. brucei.

T. b. brucei alfa- en bèta-tubuline-genen werden tot expressie gebracht in E. coli met behulp van het pTrP2-expressieplasmide en 3-¿-indoleacrylzuur als inductor. De tot expressie gebrachte tubulines werden geanalyseerd met SDS-PAGE en bevestigd door Western blotting, waarin ze een identieke schijnbare molecuulmassa van 50 kDa hadden. De tot expressie gebrachte tubulines werden afzonderlijk opgelost in 8 M ureum en 20-voudig verdund, waarna ze werden geconcentreerd en uitgebreid gedialyseerd tegen MES-buffer. Na dialyse was de gemiddelde opbrengst voor zowel alfa- als bètatubuline 0,7 g per liter kweek. Polyklonale antilichamen werden geproduceerd in elk van de 56 konijnen die waren geïmmuniseerd met drie doses van de geconcentreerde tubulines van 150 ¿g of 450 ¿g per immunisatie per dier. Het effect van deze antilichamen op T. b. brucei-groei werd bestudeerd door T. b. brucei bloedstroom in tot 25% van de door konijnen gefokte antisera. De antisera van de andere konijnen remden T. b. brucei groei in cultuur. Deze resultaten tonen aan dat antilichamen tegen bacterieel tot expressie gebracht trypanosoom tubuline mogelijk niet cytotoxisch zijn voor T. b. brucei.

T. b. brucei alfa i beta tubuliny eksprymowano w E. coli przy u¿yciu plazmidu ekspresyjnego pTrP2 i kwasu 3-¿-indoloakrylowego jako induktora. Wyräone tubuliny analizowano metod¿ SDS-PAGE i potwierdzano metod¿ Western blot, w której miäy identyczn¿ pozorn¿ mas¿ cz¿steczkow¿ 50 kDa. Wyräone tubuliny indywidualnie rozpuszczono w 8 M moczniku i rozcie¿czono 20-krotnie, po czym zat¿¿ono i ekstensywnie dializowano wobec buforu MES. Po dializie ¿rednia wydajno¿¿ zarówno dla tubuliny alfa, jak i beta wynosi¿a 0,7 g na litr kultury. Przeciwciäa poliklonalne wytworzono u kädego z 56 królików immunizowanych trzema dawkami st¿¿onych tubulin w ilo¿ci 150 ¿g lub 450 ¿g na immunizacj¿ na zwierz¿. Wp¿yw tych przeciwciä na T. b. wzrost brucei badano przez hodowanie T. b. brucei tworz¿ do 25% surowic odporno¿ciowych wyhodowanych przez królika. Surowice odporno¿ciowe innych królików nie hamowäy rozwoju T. b. wzrost brucei w kulturze. Wyniki te pokazuj¿, ¿e przeciwciäa przeciwko wyräanej w bakteriach tubulinie trypanosomu mog¿ nie by¿ cytotoksyczne dla T. b. brucei.

T. b. brucei alpha et beta tubuline gènes ont été exprimés dans E. coli en utilisant le plasmide d'expression pTrP2 et l'acide 3-¿-indoleacrylique comme inducteur. Les tubulines exprimées ont été analysées par SDS-PAGE et confirmées par Western blot, dans lequel elles avaient une masse moléculaire apparente identique de 50 kDa. Les tubulines exprimées ont été dissoutes individuellement dans de l'urée 8M et diluées 20 fois, après quoi elles ont été concentrées et largement dialysées contre du tampon MES. Après la dialyse, le rendement moyen de la tubuline alpha et bêta était de 0,7 g par litre de culture. Des anticorps polyclonaux ont été produits chez chacun des 56 lapins immunisés avec trois doses de tubulines concentrées à 150 µg ou 450 µg par immunisation et par animal. L'effet de ces anticorps sur T. b. brucei a été étudiée en cultivant T. b. brucei se forment dans jusqu'à 25% des antisérums élevés chez le lapin. Les antisérums des autres lapins n'ont pas inhibé T. b. brucei croissance en culture. Ces résultats montrent que les anticorps dirigés contre la tubuline trypanosomienne exprimée par des bactéries peuvent ne pas être cytotoxiques contre T. b. brucei.

T. b. Los genes de tubulina alfa y beta de brucei se expresaron en E. coli utilizando el plásmido de expresión pTrP2 y el ácido 3-¿-indoleacrílico como inductor. Las tubulinas expresadas se analizaron mediante SDS-PAGE y se confirmaron mediante transferencia Western, en la que tenían una masa molecular aparente idéntica de 50 kDa. Las tubulinas expresadas se disolvieron individualmente en urea 8 M y se diluyeron 20 veces, después de lo cual se concentraron y se dializaron extensamente contra tampón MES. Después de la diálisis, el rendimiento medio de tubulina alfa y beta fue de 0,7 g por litro de cultivo. Se produjeron anticuerpos policlonales en cada uno de los 56 conejos inmunizados con tres dosis de tubulinas concentradas a 150 ¿g o 450 ¿g por inmunización por animal. El efecto de estos anticuerpos sobre T. b. El crecimiento de brucei se estudió cultivando T. b. brucei en el torrente sanguíneo hasta en un 25% de los antisueros criados en conejos. Los antisueros de los otros conejos no inhibieron T. b. crecimiento de brucei en la cultura. Estos resultados muestran que los anticuerpos contra la tubulina tripanosómica expresada en bacterias pueden no ser citotóxicos para T. b. brucei.

T. b. i geni brucei alfa e beta tubulina sono stati espressi in E. coli utilizzando il plasmide di espressione pTrP2 e l'acido 3-¿-indolacrilico come induttore. Le tubuline espresse sono state analizzate mediante SDS-PAGE e confermate mediante Western blotting, in cui avevano una massa molecolare apparente identica di 50kDa. Le tubuline espresse sono state sciolte individualmente in Urea 8M e diluite 20 volte, dopodiché sono state concentrate e dializzate ampiamente contro il tampone MES. Dopo la dialisi, la resa media sia per l'alfa che per la beta tubulina è stata di 0,7 g per litro di coltura. Anticorpi policlonali sono stati prodotti in ciascuno dei 56 conigli immunizzati con tre dosi di tubuline concentrate a 150 ¿g o 450 ¿g per immunizzazione per animale. L'effetto di questi anticorpi su T. b. la crescita dei brucei è stata studiata mediante coltura di T. b. brucei si forma il flusso sanguigno fino al 25% degli antisieri di coniglio. Gli antisieri degli altri conigli non hanno inibito T. b. brucei crescita nella cultura. Questi risultati mostrano che gli anticorpi contro il tripanosoma tubulina espresso dai batteri possono non essere citotossici per T. b. brucei.

T. b. brucei alpha und beta tubulin Gene wurden in E. coli unter Verwendung des pTrP2 Expressionsplasmids und 3-¿-Indoleacrylsäure als Induktor exprimiert. Die exprimierten Tubuline wurden durch SDS-PAGE analysiert und durch Western Blot bestätigt, wobei sie eine identische scheinbare Molekülmasse von 50 kDa hatten. Die exprimierten Tubuline wurden einzeln in 8 M Harnstoff gelöst und 20-fach verdünnt, wonach sie konzentriert und ausgiebig gegen MES-Puffer dialysiert wurden. Nach der Dialyse betrug die durchschnittliche Ausbeute für Alpha- und Beta-Tubulin 0,7 g pro Liter Kultur. Polyklonale Antikörper wurden in jedem der 56 Kaninchen hergestellt, die mit drei Dosen der konzentrierten Tubuline entweder bei 150 & mgr; g oder 450 & mgr; g pro Immunisierung pro Tier immunisiert waren. Die Wirkung dieser Antikörper auf T. b. Das Wachstum von Brucei wurde durch Kultivieren von T. b. Brucei-Blutkreislauf bilden sich in bis zu 25% der von Kaninchen gezüchteten Antiseren. Die Antiseren der anderen Kaninchen hemmten T. b nicht. Brucei Wachstum in der Kultur. Diese Ergebnisse zeigen, dass Antikörper gegen bakteriell exprimiertes Trypanosomentubulin für T. b möglicherweise nicht zytotoxisch sind. Brucei.